جدول شماره­ ۳-۱ – مواد لازم در مخلوط واکنش ترانویسی معکوس (RT)

مقدار مواد
نوع ماده

۲

dNTPs (10 mM)

۲

DTT (Dithiotreitol) (100 mM)

۱۰

Mmulv RT buffer (5x)

۳

Reverse Primer (N1T) 10µM

۳۲

Deionized water

cDNA ساخته شده بطریق فوق یا بلافاصله بکار برده شد و یا برای مصارف بعدی در ۲۰- درجه سانتی ­گراد نگهداری گردید

( اینجا فقط تکه ای از متن فایل پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

۳-۹- انجام واکنش PCR
۳-۹-۱- طراحی پرایمر
پرایمرهای مورد استفاده در این تحقیق بر اساس آنالیز هم ردیف سازی توالی مربوط به ۶۵ ایزوله و سویه از ویروس Y سیب زمینی (که از بانک جهانی ژن NCBI دانلود شده بود) طوری طراحی گردید که بتوانند تمام ایزوله­های احتمالی را تکثیر کنند که توالی این پرایمرها به شرح زیر می باشد :
جدول ۳-۲- توالی و موقعیت آغازگرهای مورد استفاده در این تحقیق

موقعیت آغازگر دمای اتصال قطبیت توالی نام آغازگر
روی ژنوم

F1 CAA CTC CAG ATG GAA CAA TTG مستقیم ۵۸ ۷۸۸۲-۷۸۶۱
F2 GCC AAC TGT GAT GAA TG 8875-8858 57 مستقیم
R1 CCA TTC ATC ACA GTT GGC 8875-8858 57 معکوس
R2 GTAGAG TAT GCA TAC TTG GAG9318-9298 56 معکوس

پس از انجام واکنش RT و ساخت cDNA، جهت تکثیر cDNAی تولید شده، واکنش PCR انجام شد. در زمان اجرای آزمایش­ها برای جلوگیری از بروز خطای زمان، برداشتن مقادیر بسیارکم مواد و نیز برای راحتی و سرعت عمل بیشتر، محلول پایه واکنش­های PCR طبق جدول ۳-۴ تهیه شد. محلول پایه شامل همه مواد مورد نیاز برای واکنش به جز cDNA و آغازگرهای اختصاصی هر نژاد بود.
۳-۹-۲ روش آزمون واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR)
برای انجام واکنش PCR از ترکیبات لازم طبق جدول شماره­ ۳-۲ و آغازگرهای جدول شماره­ ۳-۴ استفاده شد. آغازگرهای اختصاصی برای MDMV با بهره گرفتن از نرم افزار Fast PCR طراحی شدند (شکل ۳-۲). برنامه PCR متشکل از یک چرخه­ی ۹۴ درجه سانتیگراد به مدت ۴ دقیقه به منظور واسرشته سازی اولیه و ۳۵ چرخه شامل واسرشته سازی در ۹۴ درجه سانتیگراد به مدت یک دقیقه ، اتصال به مدت یک دقیقه در دمای مناسب برای هر جفت آغازگر (جدول شماره­ ۳-۴) و سنتز در ۷۲ درجه به مدت یک دقیقه و به علاوه یک چرخه در دمای ۷۲ درجه به مدت ۱۵ دقیقه برای امتداد رشته­ها بود (جدول شماره­ ۳-۳). PCR در دستگاه Thermocycler شرکت اپندورف و یا مدل iCycler شرکت Biorad انجام شد.
جدول شماره­ ۳-۳- مواد لازم در واکنش PCR