(۱-۲) منحنی استانداردها ۷۶
چکیده
بررسی میزان آفلاتوکسین در کنسانتره های مصرفی گاوهای شیری شهرستان گرمسار
مایکوتوکسین ها متابولیت های ثانویه قارچ های رشته ای هستند که در مراحل پایانی رشد قارچ های رشته ای تولید می شوند. آفلاتوکسین ها از مهمترین مایکوتوکسین ها هستند که شامل _۱B,₂B,₁G,₂G می باشند، که توسط گونه های آسپرژیلوس فلاووس ، آسپرژیلوس پارازیتیکوس وآسپرژیلوس نومیوس تولید می شوند.چنانچه شرایط حرارت و رطوبت مناسب باشد این قارچ ها بر روی سوبستراهای مناسب مانند دانه های غلات و خوراک دام رشد کرده و تولید سم می کنند.در این بین آفلاتوکسین _۱Bاز همه مهمتر و خطرناکتر می باشد که با مصرف خوراک آلوده به آن توسط دام شیروار در کبد حیوان متابولیزه شده، و به صورت آفلاتوکسین _۱M در شیر ترشح می شود که اگر بیش از حد مجاز باشد، سلامت جوامع بشری را به مخاطره می اندازد. در این مطالعه ۸۰ نمونه کنسانتره ی گاو شیری از دامداریهای مختلف شهرستان گرمسار در سه فصل زمستان،بهار و تابستان بصورت تصادفی اخذ شد و به وسیله ی روش الایزا که روشی سریع و حساسی میباشد، میزان آفلاتوکسین _۱Bاندازه گیری شد.از میان ۸۰ نمونه ی مورد بررسی ۳۰ نمونه(۳۷.۵%) دارای آلودگی بالاتر از حد مجاز(۵میکروگرم بر کیلوگرم) در محدوده ی ۱۵/۶-۵۲/۱۸میکروگرم بر کیلوگرم را نشان دادند.میانگین آلودگی در فصل زمستان،ر بهار ورتابستان به ترتیب،۹۹/۶،۴۹/۴ و ۱۳/۳ میکروگرم بر کیلوگرم بود.بالاترین میزان آلودگی مربوط به فصل زمستان با۵۲/۱۸میکروگرم بر کیلوگرم و پایین ترین میزان آلودگی مربوط به فصل تابستان با ۵۱/۱ میکروگرم بر کیلوگرم بود.مقایسه بین میزان آفلاتوکسین در فصول زمستان،بهار و تابستان بیانگر اختلاف آماری معنی دار بین این سه فصل می باشد.
کلمات کلیدی:آفلاتوکسین _۱B،کنسانتره،الایزا،شهرستان گرمسار
فصل اول
کلیات
۱-۱ مقدمه و هدف
مایکوتوکسین‌ها^[۱] از جمله آلاینده‌های محیطی مهم محسوب می‌شوند که می‌توانند بر روی انواع دانه، مغزدانه و سایر اجزای نباتی تولید شوند. تماس انسان و حیوانات با این دسته از سموم از طریق خوراکی، استنشاقی و یا تماس مستقیم صورت می‌گیرد و در این رابطه، حتی مقادیر بسیار ناچیز این ترکیبات می‌تواند مخاطره‌آمیز باشد. قارچ‌های مولد سم می‌توانند بر روی طیف وسیعی از سوبستراها نظیر برگ‌ها و ساقه‌های درحال رشد، دانه‌ها، میوه‌ها و محصولات غذایی گیاهی و حیوانی رشد کرده و سم تولید کنند. با این حال، برخی سوبستراها برای تولید حداکثر میزان سم مناسب‌ترند که علت آن می‌تواند نوع ترکیب شیمیایی آن‌ها باشد. در این رابطه، ویژگی سوبسترا برای قارچ یکی از مهمترین جنبه‌های تحقیقات انجام گرفته بر روی مایکوتوکسین‌ها در زمینه‌ی آلودگی اغذیه حیوانی و انسانی است. قارچ‌های مولد مایکوتوکسین‌ قادرند در مراحل مختلف کاشت، داشت، برداشت و انبارداری باعث آلودگی محصولات کشاورزی گردند.

(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

امروزه اکثر مایکوتوکسین‌ها را می توان در سطح قابل قبولی از لحاظ نیازهای قانونی، دامپزشکی و پزشکی مورد شناسایی قرار داد.انتخاب روش‌های مناسب استخراج و تجزیه برای شناسایی این دسته از سموم در اغذیه انسانی و حیوانی، افزودنی‌های خوراکی، بافت‌ها و مایعات بیولوژیک نظیر خون، ادرار و شیر حیوانات حائز اهمیت می‌باشد. و اکثر مطالعات در راستای افزایش حساسیت، دقت و تکرارپذیری و مهم‌تر از همه کاهش زمان آنالیز متمرکز شده است (۵).
در این راستا در تحقیق حاضر از روش الایزا (ELISA)^[2] که هم ساده‌تر از روش‌های دیگر، و هم داده‌ها باثبات‌ تر بوده و انحراف معیار نسبتاً پایین‌تری نسبت به روش های دیگر دارد استفاده کردیم. با این روش می‌توان مقادیر در حدود ۵ قسمت در بیلیون (ppb) از آفلاتوکسین‌ B₁ را مستقیماً پس از عصاره‌گیری نمونه (بدون اعمال مرحله‌ی پالایش) مورد شناسایی قرار داد. این روش در مقایسه با سایر روش‌های تعیین کمیت به زمان و هزینه کم‌تری نیاز دارد(۵).
۱-۲ تاریخچه:
واژه مایکوتوکسین از دو لغت یونانی myke به معنای قارچ و Toxicium به معنای سم گرفته شده است. پیدایش دانش مایکوتوکسیکولوژی^[۳] به سال ۱۹۶۰ همزمان با ارائه گزارش مبنی بر شیوع یک بیماری مرموز بین بوقلمون‌های جنوب شرقی انگلستان مربوط می‌شود.
این بیماری ناشناخته را بیماریX بوقلمون^[۴] نامیدند، که منجر به مرگ حدود صدهزار بوقلمون جوان و دهها هزار جوجه اردک و قرقاول گردید. همزمان گزارشات متعددی از مسمومیت مشابه در اوگاندا، امریکا و انگلستان در انواع دیگر حیوانات مثل ماهی و جوجه اردک گزارش شد(۷).آفلاتوکسین B₁ با بهره گرفتن از کروماتوگرافی کاغذی از عصاره کلروفرمی دانه‌های بادام زمینی آلوده جداسازی شد و به صورت یک لکه آبی رنگ زیر نور ماوراء بنفش مشاهده گردید. واژه آفلاتوکسین به دنبال جداسازی و شناسایی این سم و عامل تولید کننده‌ی آن، یعنی آسپرژیلوس فلاووس^[۵]، از مواد غذایی آلوده از ترکیب اختصار کلمات توکسین و آسپرژیلوس فلاووس به دست آمد.در مراحل بعدی، محققین روش کروماتوگرافی لایه‌ی نازک^[۶] را مورد استفاده قرار دادند و به این ترتیب، ۴ لکه‌ی مجزا و تفکیک شده رؤیت شد. نامگذاری آفلاتوکسین‌های طبیعی بر روی صفحه کروماتوگرافی لایه نازک پوشیده از ژل سیلیکا به این صورت انجام گرفت که دو لکه آبی رنگ فوقانی را از بالا به پایین B₁ و B₂ نامیدند(B از اول کلمه‌ی Blue گرفته شده است) و دو لکه ی متمایل به سبز تحقیقاتی را از بالا به پایین G₁ و G₂ نام نهادند( G از اول کلمه‌ی Green اقتباس شده است )(۵).
آتروف (Autrup) و همکاران در سال برای اندازه‌گیری آفلاتوکسین در ادرار از روش^[۷] سینکرونوس فلورسنس اسپکتروسکوپی استفاده کردند.ویلد وهمکاران( ۱۹۸۶) روش‌های ارزیابی سیستم ایمنی را که دارای حساسیت قالبل توجهی است، برای تعیین میزان آفلاتوکسین در مایعات بدن انسان به‌کار بردند.
یارک(Iarc) وهمکاران (۱۹۸۸) آفلاتوکسین B₁ را در لیست مواد سرطانزای انسانی قرار داد (۸۶).
بر اساس گزارشات سازمان غذا و کشاورزی سازمان ملل متحد (FAO) هر ساله میلیون‌ها تن مواد غذایی در اثر آلودگی با مایکوتوکسین‌ها از بین می‌رود. لذا در سال ۱۹۸۸ برنامه‌ریزی‌های زیادی همراه با کارگروه‌های آموزشی برای کنترل بهداشتی مواد غذایی در سرتاسر دنیا صورت گرفت. در سال ۱۹۹۰ بنا به گزارش مرکز کنترل بیماری‌ها^[۸] در کشور آمریکا عامل ایجاد بسیاری از موارد مسمومیت‌های غذایی، میکروب‌ها و قارچ‌های بیماری‌زا بوده‌اند.
از سال ۱۹۹۰ روش کروماتوگرافی لایه نازک^[۹] به عنوان یکی از روش‌های متداول جداسازی آفلاتوکسین مورد توجه بوده و به منظور تشخیص و تعیین مقادیر کمی آفلاتوکسین به کار رفته است. در این روش میزان سم بر حسب نانوگرم بر گرم( ng/g )گزارش می‌شود (۱۰).
۱-۳ مایکوتوکسین‌ها به عنوان متابولیت‌های ثانویه
مایکوتوکسین‌ها به همراه سایر متابولیت‌های قارچی نظیر آنتی بیوتیک‌ها، آلکالوئیدها^[۱۰] و نظایر آنها ترکیباتی هستند که در مراحل پایانی رشد قارچ‌های رشته‌ای^[۱۱] به وسیله‌ی سلول‌های قارچی تولید می‌شوند. این گونه متابولیت‌ها که تحت عنوان متابولیت‌های ثانویه^[۱۲] شناخته شده‌اند و ظاهراً برای خود سلول‌ قارچی هیچگونه فایده‌ای ندارند. از طرف دیگر، متابولیت‌های اولیه^[۱۳] نظیر اسید‌های آمینه، اسیدهای چرب، قندها، اسیدهای نوکلئیک‌ و پروتئین‌ها برای تمامی ارگانیسم های زنده ضروری هستند. فرآیندهای متابولیکی که به تولید متابولیت‌های اولیه می‌انجامند متابولیسم اولیه^[۱۴] نامیده می‌شوند، در حالی که متابولیت‌های ثانویه محصولات نهایی متابولیسم ثانویه^[۱۵] محسوب می گردند.
متابولیت‌های ثانویه از نظر ساختمانی ترکیبات آلی نسبتاً کوچک دارای ساختمانی شیمیایی پیچیده محسوب می‌شوند. اینگونه متابولیت‌ها، به ویژه مایکوتوکسین‌ها را می توان بر اساس مسیرهای بیوسنتزی آنها طبقه‌بندی کرد. فرآیندهایی که به تولید متابولیت‌های اولیه و ثانویه می‌ انجامد با واسطه‌ی تعداد اندکی از ترکیبات ساده نظیر استیل‌کوآنزیم A^[16]، موالونیک اسید^[۱۷] و اسیدهای آمینه صورت می‌پذیرد(۵).
۱-۴ طبقه‌بندی مایکوتوکسین‌ها:
روش‌های مختلفی جهت طبقه‌بندی مایکوتوکسین‌ها به کار گرفته شده است که در این میان، طبقه‌بندی بر اساس مسیرهای بیوسنتز جامع‌تر از سایرین می‌باشد. در این رابطه مایکوتوکسین‌ها در چهار گروه اصلی زیر قرار می‌گیرند:
مایکوتوکسین‌های مشتق از پلی کتاید:
مسیر پلی‌کتاید مهمترین مسیر بیوسنتز مایکوتوکسین‌ها محسوب می‌شود که با واسطه استیل کوآنزیم A انجام می‌گیرد و به تولید مایکوتوکسین‌هایی نظیر آفلاتوکسین، اوکراتوکسین^[۱۸]، پاتولین^[۱۹]، سیترینین^[۲۰]، پنی‌سیلیک‌اسید^[۲۱] و غیره می‌ انجامد(۵).
مایکوتوکسین‌های مشتق از موالونات:
ترایکوتسن‌ها مهمترین مایکوتوکسین‌های تولید شده از طریق مسیر موالونات هستند که علاوه بر جنس فوزاریوم بوسیله جنس‌های دیگر از قارچ‌ها نظیر میروتسیوم، تریکودرما، تریکوتسیوم و سفالوسپورم نیز تولید می‌شوند.
مایکوتوکسین‌های مشتق از پلی‌پیتیدهای حلقوی و مشتقات آنها:
در رابطه با مایکوتوکسین‌های مشتق از ‌پیتیدهای چند حلقوی می‌توان به ایسلندی توکسین، اسپوری دسمین، گلیوتوکسین و ارگوتامین اشاره کرد. این گروه از سموم به دنبال الحاق اسیدهای آمینه به پیتیدهای ماکروسیلیک و یا ترکیبات پلی‌سیلیک تولید می‌شوند.
مایکوتوکسین‌های مشتق از اسیدهای آمینه و موالونات:
تریپتوفان و احتمالاً سایر اسیدهای آمینه در تشکیل مایکوتوکسین‌های مشتق از اسید آمینه و موالونات به گروهی از واحدهای ایزوپرن مشتق شده از موالونات متصل می شوند و به این ترتیب، سمومی نظیر آفلاترم و راکفورتین C تولید می‌گردند(۵).
۱-۵- خواص عمومی مایکوتوکسین‌ها
از نظر ساختمانی غالباً هیدروکربن‌های حلقوی و به‌ ندرت هیدروکربن‌های خطی می‌باشند.
اکثراً وزن مولکولی پایینی دارند و به همین دلیل، به تنهایی فاقد خاصیت آنتی‌ژنتیک بوده و بالطبع قادر به تحریک سیستم ایمنی میزبان نیستند.
بر اساس تمایل به بافت هدف، تحت عناوین مختلفی نظیر هپاتوتوکسین، نوروتوکسین، نفروتوکسین، ژنیتوتوکسین، کاردیوتوکسین، درماتوتوکسین، گاسترو اینتستینال توکسین و غیره نامگذاری شده‌اند(۴).
در مقابل عوامل فیزیکی نظیر حرارت، آسیاب کردن و سایر اعمالی که بر روی مواد غذایی خام تا مراحل بسته‌بندی اعمال می‌گردد مقاوم می‌باشند.
جزو مسمومیت‌زاهای بالقوه هستند زیرا تحت شرایط مختلف باعث آلودگی مواد غذایی می‌شود.
گروهی از آن‌ها اثرات چندگانه دارند و علاوه بر مسمومیت قادر به ایجاد اختلالات مختلف می‌باشند(۲).
۱- ۱: ساختمان شیمیایی مایکوتوکسین‌های مهم(۵) ادامه تصویر ۱- ۱: ساختمان شیمیایی مایکوتوکسین‌های مهم(۵)
تصویر ۱- ۱: ساختمان شیمیایی مایکوتوکسین‌های مهم(۵)
۱-۶ مهمترین قارچ‌های مولد سم^[۲۲]
مهمترین جنس های فلور قارچ و و مولد سم د رمواد غذایی به شرح ذیل می باشند که از این میان سه جنس آسپرژیلوس و فوزاریوم وپنی سیلیوم مهمترین آنها و همچنین مهمترین جنسهای مولد مایکوتوکسین ها می باشند.
۱-۶-۱ جنس آسپرژیلوس
گونه های این جنس جزء‌معمول ترین آلوده کننده های سوبسترهای مختلف هستند. تعدادی از گونه های این جنس در انسانها و حیوانات بیماریزا می باشد. و تعدادی توانایی تولید متابولیت های سمی دارند. جنس آسپرژیلوس بوسیله تولید مقدار قابل توجهی از کونیدی های تک سلولی کوچک که منشأ آنها فیالید هایی است که به طور منظم بر روی رأس متورم کونیدیوفور قرار گرفته اند توصیف می شود.
۱-۶-۲ جنس پنی‌سیلیوم^[۲۳]
اعضاء متعلق به این جنس قارچی بوسیله تولید کونیدیوم‌های تک‌سلولی کوچکی توصیف می‌شود که از فیالیدهای قرار گرفته به صورت یک ساختمان قلم‌مو شکل منظم بر روی انتهای کونیدیوفورهای هوایی منشاء می‌گیرند. مهم‌ترین سموم تولید شده توسط گونه‌های پنی‌سیلیوم شامل سیتروئوویدین، سیترینین، پاتولین، پنی‌سیلیک اسید، سم PR، پنی‌ترم A، پاکسیلین و روبراتوکسین هستند(۵).
۱-۶-۳ جنس فوزاریوم^[۲۴]
تولید میکروکونیدیوم و کلامیدیو سپور انتهایی یا میانی، میزان رشد و تولید رنگدانه بر روی محیط اختصاصی به همراه شکل و اندازه ماکروکونیدیوم در شناسایی گونه‌های مختلف این جنس مورد استفاده قرار می‌گیرد.گونه های متعدد فوزاریوم به علت تولید مایکوتوکسینهای مختلف معرف شده اند . مهمترین توکسین های تولید شده توسط فوزاریوم ها شامل: فومونیزین ها ،‌تریکوتسن ها ( T-2 توکسین، دی اکسی نیوالنون و…) زرالنون ، فوزارینا ،‌و مونیلی فورمین می باشد(۵).
۱-۶-۴سایرجنسهای قارچی
بسیاری از جنس های قارچی نظیرآلترناریا۱ ،کتومیوم ۲،فوما ۳،کلاویسپس۴ ، کلادوسپوریویم ۵وغیره بعنوان جنس های با اهمیت ازنظرتولید مایکوتوکسین مطرح می باشند(۵).
۱-۷ مکانیسم اثر مایکوتوکسین‌ها