۲-۵-۱- تهیه محلول آکریل‌ آمید و بیس آکریل آمید
برای تهیه این محلول ۱۹ گرم پودر آکریل آمید و ۱ گرم پودر بیس آکریل آمید در آب مقطر حل شد و حجم آن به ۵۰ میلی‌لیتر رسانده شد. محلول در ظرف شیشه‌ای تیره و در دمای اتاق نگه‌داری گردید. شرایط قلیایی باعث تسریع واکنش تبدیل آکریل آمید و بیس آکریل آمید به آکریلیک اسید و بیس آکریلیک اسید می شود.

(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

۲-۵-۲- تهیه محلول سدیم دودسیل سولفات ۱۰%
۱گرم پودر SDS در ۱۰ میلی‌لیتر آب مقطر حل شد و در دمای اتاق نگه‌داری گردید زیرا محلول SDS در دمای یخچال منجمد می‌شود. SDS عاملی برای دناتوره شدن پروتئین‌های طبیعی که به صورت پلی‌پپتید وجود دارند می‌باشد. هنگامی که مخلوط پروتئین تا ۱۰۰ درجه سانتیگراد در حضور SDS حرارت داده شود، به پلی‌پپتید با نسبت وزنی ثابت ۴/۱ متصل شده و به آن بار منفی می‌دهد. در نتیجه امکان جداسازی پروتئین‌ها را بر اساس وزن مولکولی آن‌ها فراهم می‌کند.
۲-۵-۳- تهیه محلول آمونیوم‌پرسولفات ۱۰%
۱/۰ گرم پودر آمونیوم‌پرسولفات را در ۱ میلی‌لیتر آب مقطر حل شد. این محلول بایستی برای هر بار تهیه ژل به صورت تازه تهیه گردد. برای شروع پلیمریزاسیون و تشکیل ژل به آمونیوم‌پرسولفات نیاز داریم تا با ایجاد رادیکال‌های آزاد باعث اتصال زنجیرهای آکریل‌آمید و بیس‌آکریل‌آمید شود. آمونیوم‌پرسولفات ترکیب شونده‌ای قوی با اکسیژن است و اکسیژن را از مخلوط حذف می‌کد، چون وجود اکسیژن بر میزان و بازدهی پلیمریزه شدن اثر کرده و آن را کاهش می‌دهد.
۲-۵-۴- تهیه بافر نمونه X2
۳/۰ گرم از تریس توزین شد و داخل یک بشر کوچک ریخته و به آن مقدار کمی آب مقطر اضافه شد و بر روی استیرر قرار گرفت. سپس اسیدکلریدریک خالص ۱۰ برابر رقیق شده، با میکروپیپیت به محلول تریس اضافه گردید تا pH آن به ۸/۶ برسد. سپس ۲ گرم SDS و ۷۴/۵ میلی‌لیتر گلیسرول را در داخل یک استوانه مدرج ریخته و با محلول تریس-اسیدکلریدریک pH ۸/۶ مخلوط گردید و سپس ۰۱۲۵/۰ گرم بروموفنل به آن اضافه شد و با آب مقطر به حجم ۲۵ میلی‌لیتر رسانده شد. بروموفنل معمول‌ترین رنگ استفاده شده برای پیگیری نمونه‌ها است. اتصال آن به پروتئین ضعیف بوده و به دلیل کوچک بودن ، جلوتر از پروتئین حرکت می‌کند. همچنین گلیسرول باعث سنگین شدن نمونه‌ها شده تا بتوانند در چاهک‌های ایجاد شده در ژل قرار گیرند.
۲-۵-۵- تهیه محلول رنگ‌آمیزی کوماسی بلو
برای تهیه این محلول ۶۰۰ میلی‌لیتر اتانول، ۱۰۰ میلی‌لیتر اسیداستیک و ۴ گرم رنگ کوماسی بلو R250 در یک ارلن ریخته و با آب مقطر به حجم ۲ لیتر رسانده شد. سپس بر روی استیرر قرار گرفت تا محلول با رنگ خوب مخلوط شود. برای جلوگیری از تابش نور به محلول درون ظرف، ظرف را با کاغذ آلومینیومی پوشانده شد و در دمای اتاق نگه‌داری گردید. کوماسی بلو R250 یک رنگ آمینوتری‌آریل‌متان است که به صورت محکم (اما نه به صورت کووالانسی) به کمپلکس پروتئین‌ها از طریق میان‌کنش‌های واندروالسی و الکترواستاتیک با گروه متصل می‌شود. ساختار این رنگ به صورت غالب غیرقطبی است بنابراین در اتانول و اسیداستیک تهیه می‌شود. تثبیت کننده پروتئین‌ها در ژل اسیداستیک است.
۲-۵-۶- تهیه محلول رنگ‌بر
برای تهیه این محلول ۶۰۰ میلی‌لیتر اتانول و ۱۰۰ میلی لیتر اسیداستیک خالص را با ۱۳۰۰ میلی‌لیتر آب مقطر خالص به حجم ۲ لیتر رسانده شد.
۲-۵-۷- تهیه بافر مهاجرت
۱۲ گرم تریس، ۶/۵۷ گرم گلیسین و ۲ گرم سدیم‌دودسیل‌سولفات با آب مقطر به حجم دو لیتر رسانده می شود. سپس با بهره گرفتن از هم‌زن خوب مخلوط می‌گردد.
۲-۶- تکنیک SDS-PAGE کاهشی
تکنیک SDS-PAGE کاهشی به ترتیب مراحل زیر انجام می‌شود:
۱) اسلایدهای شیشه‌ای مخصوص ساخت ژل را به خوبی شسته و در نهایت برای حذف هر گونه آلودگی با اتانول ۷۰% تمیز گردید.
۲) سپس اسلایدهای شیشه‌ای را در داخل سلول مخصوص خود قرار داده به طوری که قسمت U شکل اسلاید به سمت داخل سلول باشد. سپس پیچ‌های سلول را محکم کرده تا سلول در جای خود ثابت شود.
۳) سلول را بر روی پایه مخصوص خود قرار داده در این مرحله باید دقت شود که پس از بستن سلول روی پایه شیشه‌ها از جای تثبیت شده خود ‌خارج نشود و برای اطمینان از عدم نشت ژل، مقداری اتانول در اسلایدهای شیشه‌ای ریخته و پس از گذشت مدت زمان ۱۰ دقیقه و در صورت عدم نشت ژل با احتیاط،اتانول واقع در اسلایدهای شیشه‌ای دور ریخته می‌شود.
۴) سپس با بهره گرفتن از جدول ۲-۳ اقدام به ساخت ژل تفکیک کننده کرده. ترتیب اضافه کردن مواد برای تهیه ژل تفکیک کننده از این قرار است: آب مقطر، بافر تریس اسیدکلریدریک pH ۸/۸، محلول آکریل‌آمید، محلول SDS ۱۰% و تمد می‌باشد. سپس این مواد قبل از ریختن درون اسلاید خوب مخلوط می‌شوند. لازم به ذکر است که تمد را قبل ریختن ژل درون اسلاید اضافه کرده زیرا پش از افزودن تمد، ژل به سرعت می‌بندد.
۵) ژل ساخته شده را در اسلاید شیشه‌ای ریخته تا حدی که ۲ سانتی‌متر با سطح اسلاید فاصله داشته باشد. توجه شود که باید با دقت و آهسته کار کرد تا از ایجاد حباب جلوگیری شود. بلافاصله بعد از ریختن ژل، اتانول ۹۶% را بر روی آن ریخته تا شرایط بی‌هوازی برای فعالیت تمد فراهم شود و همچنین سطح ژل را صاف نموده.
۶) بلافاصله بعد از اضافه کردن تمد، ژل شروع به پلیمریزه شدن می‌کند. پس از اینکه اضافه ژل پلیمریزه شد، اتانول موجود روی سطح ژل را دور ریخته و با آب مقطر شست و شو داده و با کاغذ صافی خشک می‌نماییم.
۷) در این مرحله اقدام به ساختن ژل پشته سازی بر اساس جدول ۲-۳ گردید. ترتبب اضافه کردن مواد برای تهیه ژل پشته سازی از این قرار است: آب مقطر، بافر تریس اسید-کلریدریک pH ۸/۶، محلول آکریل‌آمید، محلول SDS ۱۰%، محلول آمونیوم‌پرسولفات ۱۰% و تمد می‌باشد. سپس این مواد قبل از ریختن درون اسلاید خوب مخلوط می‌گردند.
۸) ژل تا لبه شیشه کوتاه پر می‌شود و بلافاصله شانه مخصوص درست کننده چاهک در آن فرو برده می‌شود که باید به طور معمول با ژل پایینی ۵/۰ سانتی‌متر فاصله داشته باشد.
۹) بعد از اینکه ژل پلیمریزه شد، شانه را به آرامی از داخل ژل بیرون کشیده و باید مراقب بود که در این مرحله به جاهک‌ها آسیبی وارد نشود.
۱۰) سپس سلول از پایه‌اش جدا شده و در داخل تانک قرار گرفت. قسمت وسطی و بیرونی سلول از بافر تانک پر می‌شود به صورتی که تمام سطح ژل را بپوشاند.
۱۱) در حین بستن ژل آماده‌سازی نمونه‌‌ها صورت می‌گیرد.
جدول ۲-۳، ترکیب الکتروفورز SDS-PAGE کاهشی ۱۲%

محلول

ژل پشته سازی(ml)

ژل تفکیک کننده(ml)

تریس ۲ مولار pH 8/8

-‌-‌-‌-‌-

۳۳/۱

تریس ۵/۰ مولار pH 8/6

۴۵/۰

-‌-‌-‌-‌-

اکریل‌آمید ۴۰%

۶/۰

۴/۲